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        2015版中國藥典微生物項變化的應對策略:培養基

        2015-12-29 點擊數:1121
        培養基對于做微生物的來說就好比是天文學家觀察宇宙天體的哈勃望遠鏡一樣,通過哈勃望遠鏡你可以看到黑洞的盤狀構造,也可能發現太陽系外的其他行星,就像我們的培養基,讓我們人類能發現那些小小的菌種并觀察它們的形態,所以培養基的質量幾乎成就了我們實驗成功的一半,它對于我們微生物檢驗的意義絕不容小覷!

         

        1、 培養基配方梳理

        根據自己企業需使用的培養基整理其配方,最終篩選出的培養基必須與2015版藥典規定的培養基配方一致,值得一提的是如硫乙醇酸鹽流體培養基中的葡萄糖,在中國藥典寫5.0g,如果后續篩選國外品牌的培養基,其配方上的葡萄糖可能寫5.5g,USP上硫乙醇酸鹽流體培養基上的葡萄糖寫的是5.0g/5.5g,如果一眼看去,可能會直接剔除該國外品牌的培養基,其實并非,中國藥典寫的5.0g的葡萄糖是指無水葡萄糖,國外品牌配方中的5.5g是指一水葡萄糖,其實是可以使用的。

         

        所以對于配方的梳理相當重要,讓我們在第一步的時候不至于走錯,否則如果配方不對僅核對名稱,那最后買單的可能真的是實驗室自己了。很多人喜歡拿著藥典直接核對,自己梳理的好處是印象會更加深刻,所有培養基均整理成一個表格,便于以后查找和管理。當然每個物料對于微生物生長的作用,我覺得有興趣的同學可以了解一下,這對這次藥典為什么培養基會變化會有更深入的理解。以下舉例TSB

        2、 培養基供應商的篩選

        這里指的培養基包括培養基干粉及成品培養基,干粉指的是按藥典配方生產的培養基干粉,直接溶解滅菌即可使用,成品培養基是指用按藥典配方生產的培養基干粉制備出的預灌裝的平皿及液體培養基,即配制好的培養基可直接使用。

        對于品牌的篩選每個實驗室仁者見仁智者見智,都有一套自己的評判標準,如成本或到貨周期的考量,但是適用性檢查的標準只有一套,那就是藥典明確規定的培養基的適用性檢查方法。之前有個國內大型企業的實驗室主管問我們使用哪家的干粉,她說她們實驗室一共就7種培養基,但是涉及到的廠家卻有三家,比如培養基1號、2號、3號使用廠家A的,培養基4號、5號是廠家B的,培養基6號、7號是廠家C的,這樣一來就真的不好管理,因為你有那么多廠家并不是我們所謂的備選供應商的概念,他是指培養基1號就一個供應商就是廠家A如果A斷貨或質量有問題就不能選用廠家B或C的;還有一個她現在面臨的棘手問題是,廠家A培養基干粉瓶上的建議滅菌溫度是115℃、20min,廠家B培養基干粉瓶上的建議滅菌溫度是121℃、15min,這樣如果配制這2個不同廠家的培養基還不能同一批一起滅菌,因為滅菌溫度時間都不一樣,那講到這里大家又會發現一個問題,那就是如果滅菌溫度時間不一樣,那使用的滅菌器驗證時候的滅菌條件又會增加一個,包括空載/滿載熱分布、滿載熱穿透生物指示劑挑戰那一大堆的事。。。。。。聽完以后我真的是為她著急??!實驗室資源就在此時被白白浪費,不說水電吧,一支生物指示劑那就要小一百了,還是三次滿載挑戰!統一的培養基供應商統一的滅菌條件是最便于管理的,相信現在這樣的企業應該越來越少了,那正好趁這次15版改版的契機,好好篩選一下我們的培養基供應商!


        最好挑選國內或國外大型的培養基干粉生產廠家,這樣的廠家的資質審計相對會比較方便資料也齊全,另外我建議至少篩選出2家廠家,這2家廠家的產品最好是包含了實驗室需要的所有培養基干粉品種,其中1家是首選廠家,另1家是備選。選擇過程中務必結合后續希望使用的成品培養基的情況,因為大家知道現在成品培養基有的是干粉培養基生產廠家直接生產的,也有的是僅進行成品培養基預灌裝的廠家,我個人的理念是,干粉選擇什么廠家,最好對應的成品培養基的干粉原料也是這個廠家,這樣能夠最大限度的保證實驗數據的穩定。


        培養基比較有名的廠家做微生物的基本都耳熟能詳,找供應商上門先了解一下大概的情況,同時和供應商交流一下后續審計的內容,因為篩選合格的培養基供應商還是需要實驗數據說話的,供應商吹的多天花亂墜也沒有實驗數據來的有說服力!

         

        3、 培養基供應商的審計

        1)資質審計

        資質審計審什么?我們QC比較關心的內容基本包含以下一些內容,生產證書、生產工藝、配方、出廠標準、CoA、效期證明、價格、到貨周期、外包裝耐過氧化氫或其他滅菌劑滅菌證明(一般指在隔離器內經其滅菌劑外表面滅菌后使用的成品培養基)、輻照廠家輻照劑量、如國外供應商則應有進口批文還有國內授權代理書等,可參照各企業QA的供應商審計中的資質審計進行。理論上,在資質審計完成后,才能進行適用性審計,但是如果對這家供應商非常有信心,兩方面的審計也可以同步進行。

        2)適用性審計

        適用性審計基本上就是對培養基進行藥典規定的適用性檢查實驗,但是對于商品化的東西我們還是需要加入一些其他的檢查項目,我們實驗室的檢查項目分四個:外觀檢查、pH檢查、無菌性檢查、靈敏度檢查。

        干粉我們這里是選取每個品種的其中一批進行檢查,因為原本就計劃干粉和成品培養基的干粉原料是一個品牌,成品培養基的每個品種我們均進行三批次的檢查,且每批次均包含首次試驗及末次試驗,首次試驗即收到樣品后直接進行適用性檢查,合格后按要求貯存到規定效期時再進行末次試驗,首次試驗和末次試驗的檢查項目是完全一致的,確認其在規定貯存條件的有效期內適用性檢查仍符合實驗要求,也有的企業是在效期過后一周內進行,那更加具有挑戰性,其實這個看不同企業需求,雖然有的成品培養基是6個月,但是實際使用當中不會使用到那么長時間,那在近效期的時候進行末次試驗無可厚非,但是基本上廠家效期驗證肯定是做到效期之后的就如同我們藥品一樣,所以在效期過后的一周內進行末次試驗對于該培養基的考察更有意義,當然若末次試驗不合格可能面臨與供應商溝通的問題,大部分供應商是認賬的,但也不排除一些比較計較的說你們是在效期過后試驗,所以試驗結果我們不認。

         

        適用性審計中的各個檢查項目,在這里我也大致的說一下,外觀檢查項和pH檢查項是我們自己加入的檢查,外觀檢查項的話比如外包裝是否完整、培養基的顏色是否正常等,pH檢查項在干粉配制成液體培養基或者是成品培養基的確認時就很有幫助,比如我們就遇到過成品培養基剛來是合格的,但是貯存到近效期其pH就跌出下限了(特別注意SDA)。在這兩個基礎檢查項均合格后,才進行后續無菌性檢查和靈敏度檢查,這兩項就是完全按照藥典規定來進行的,特別提醒的是回收率的對照品應使用中檢所對照培養基。四項檢查均合格則判其適用性審計合格。

        以下是我們實驗進行培養基干粉及成品培養基的部分列表,因涉及到供應商所以把其名稱、貨號、批號和價格隱去。

        在上表中可以發現有些公司的成品培養基還是有這樣那樣的問題,當然廠家也解釋說因為其產品為輻照產品,我們使用的是中檢所的對照培養基未經輻照,所以回收率會不合格,但是最終我們還是要符合中國藥典的標準的,所以我們沒有讓步。還要就是若實驗做出來結果不符合要求應先確認實驗室的實驗結果,我們這里確認不合格的實驗次數起碼是三次,確認結果后再和供應商進行溝通,后續應進行供應商實驗室和我們實驗室的對比實驗,最終確定產品是否有問題。

         

        4、 培養基的包裝

        這個單獨列一條進行討論是針對自配及商購的成品培養基而言,其包裝對于日常使用、貯存有著很大的意義,不知道大家在用別的廠家買來的預灌裝的培養基有沒有細心觀察過其包裝,以下我就預制平皿及液體培養基大致分析一下現狀。

        1)預制平皿

        預制平皿的商購包裝我看到過三種,基本都是三層包裝,一種是平皿放置的習慣為5+5就是橫著放,袋子手感比較薄的,但是優勢是該袋子可降解,且因為有一定透氣性,平皿內部不易產生水滴。第二種是最里面2層是呼吸袋,最外面一層是聚乙烯材質的塑料袋。第三種是最里面一層是聚乙烯材質,外面2層是呼吸袋,后面2種均是豎直放置10塊平皿現在用的比較多。

         

        不管材質如何,一方面我們要考慮平皿外包裝對于內置平皿的貯存無菌保證、水分的流失以及使用時候拆包的方便性,另一個很重要的是對于今后放置于隔離器內經外表面滅菌后,該包裝對隔離器滅菌劑的穿透性,這個的話首先需要廠家提供的驗證證明,如防過氧化氫穿透的驗證證明,同時在后續討論的隔離器的驗證中也要進行檢測,畢竟每個企業的隔離器內滅菌的濃度和時間均不同。

         

        若自配預制平皿,有很多公司還是臨用現配的,基本其有效期為7天(按藥典要求),但我這人比較懶,希望能多用一段時間,也便于管理,所以進行了100天的貯存效期的驗證,制備好預制平皿進行預培養,預培養后進行平皿挑選,合格的平皿用兩層袋包裝后貯存使用,效期三個月,用下來還是比較不錯的。

         

        當然自配和商購的各有利弊,自配的回收率可能高于商購的(基于同一品牌干粉而言),因為商購需要進行終端滅菌,終端滅菌方法對某些菌的回收率會有一定影響,而且一批輻照批次的產品,可能放在各個位置的均勻度不夠好,會導致一條10塊的平皿中,5塊是好的另5塊不太好,以上問題在國外購買的成品培養基上沒有發現,但是國內生產成品培養基的某些廠家確實會有上述問題,所以輻照效果的考察在國內生產成品培養基的供應商審計的時候必須更加注意!但是商購的每塊平皿的灌裝量和追溯性比較好(每塊有噴碼批號有效期),包裝的密封性更好。

        2)液體培養基

        對于液體培養基,現在很多實驗室用鋁蓋膠塞對輸液瓶進行密封軋蓋,該類密封性的包裝可以延長液體培養基的貯存時間,但是對于實驗室自己使用自動軋蓋封口機進行軋蓋及滅菌的實驗室而言有兩點隱患。

        第一,滅菌安全性問題。

        滅菌時溫度升高里面的水部分變為水蒸氣,但因為密封包裝,所以瓶內壓較大,在滅菌時有爆瓶幾率,而且在滅菌后,因為培養基不能一直放置在滅菌器內,內部溫度高會導致培養基顏色加深,培養基內的成分可能有一定破壞,故一滅菌完成,壓力表歸零,滅菌器腔體達到開門溫度要求后,立即將培養基瓶取出,但是這個時候,瓶內培養基的溫度還是相當高的,在取出的時候勢必對培養基瓶有一定的晃動,之前的爆瓶率在這個時候還是存在的,這個也是因為我們有實際的案例,所以大家一定注意使用安全!

        第二,包裝可能引入污染問題。

        滅菌的溫度一般為121℃、15min,但是軋蓋使用的鋁蓋和膠塞以及軋蓋的環境可能會導致鋁蓋及膠塞間有部分微生物在該滅菌溫度時間無法全部殺滅,有導致污染的可能,實際操作過程中也發現實驗室使用的所謂的自動封口機對于輸液瓶的封口并不那么嚴密?,F實環境是一般實驗室會使用國產的鋁蓋、膠塞和輸液瓶,若本身該企業的產品為輸液瓶,則實驗室可以借用生產的條件對實驗室培養基進行包裝,那這就最好。但是多數情況下,實驗室還是需要單獨制備,因為實驗室鋁蓋、膠塞和輸液瓶使用的量較小,所以很多產品好的廠家是不會銷售這些產品給QC的,所以現實情況下QC使用的鋁蓋膠塞和瓶確實不理想。

         

        那很多人會問,那我后續做無菌檢查要使用隔離器,我也不可能使用非密封包裝形式的培養基呀,這樣我只能使用商購的成品培養基了嗎?那太貴了!老板也不同意??!好既然這樣我就把我們企業自己發明的包裝形式貢獻給各位微生物檢驗的同胞,篩選瓶子用挺多時間,終于篩選出一個相對比較滿意的輸液瓶了,輸液瓶是玻璃的,瓶口是旋轉的,瓶蓋的頂部是膠塞,便于無菌檢查的扎針,滅菌前將該瓶口擰緊后回旋半圈(滅菌時保持內外壓,減少安全問題),然后瓶身外套一層呼吸袋封口,滅菌后隔著呼吸袋回擰半圈擰緊瓶蓋,至于回旋的位置因為隔著呼吸袋去旋轉很難掌握是否擰緊的位置,所以我也想了個辦法,滅菌前瓶口擰緊時,在瓶蓋和瓶身上豎直貼上滅菌指示帶,然后用剪刀橫向剪斷瓶蓋和瓶身的條帶,然后回旋半圈,待滅菌完畢后,回擰至瓶蓋和瓶身的滅菌指示帶呈一直線即擰緊,見下圖。

        當然這個包裝必須能經受隔離器內滅菌劑滅菌的考驗,我們進入潔凈室就脫去外部呼吸袋的包裝,然后進入隔離器就是瓶子,至少經我們實驗室隔離器的驗證,能防止過氧化氫的穿透,同時用該包裝貯存硫乙醇也可以保證三個月的效期(大家可以挑戰更長時間的效期,因為硫乙醇氧化層和厭氧層的比例在該包裝里確實保持的不錯)。日常管理的話每次配制只需換瓶蓋的膠塞即可,當然了瓶子和瓶蓋我買的是國外的,膠塞我就買國產的了,成本一定要考慮,該用好的用好的,該省的就要省。當初篩選的壓力和工作量還是很大的,希望還在摸索中的實驗室不再和我們一樣走彎路,這次就把這個包裝貢獻出來,希望對大家有幫助,也希望我們中國藥企的微生物實驗室能夠在這種細節上多交流,共同進步!同時也感謝一些商購培養基和中檢所實驗室的培養基包裝對我們的啟發。

         

        說了那么多,最后說一下商購液體培養基,這個我真的是要贊國外的培養基,確實非常不錯,當然我現在也非常希望國內的液體培養基能夠加把勁,因為國內的優勢真的是供貨時間和價格,這對于企業還是具有相當誘惑力的,我們也不希望都被國外所壟斷,但是質量真的是最高的一個門檻。對于企業來說,購買商購液體培養基在這次15版藥典升級后絕對是個使用趨勢,其包裝最重要的無外乎就是無菌性、靈敏度、包裝耐隔離器滅菌等。這點國外的液體成品培養基各類包裝形式及基本資料都非常齊全,實驗室可以根據自己的需要選擇相應的包裝形式,供應商肯定在商品介紹時就會一并幫助挑選,之后符合審計要求就可以納入合格供應商的目錄使用。

        5、 對照培養基

        對于中國藥典在2010版引入對照培養基的概念,我個人是相當贊成的,就像理化試驗使用的標準品一樣,中國很多企業使用的培養基干粉質量參差不齊,導致最終實驗結果的誤判,這樣的損失真的是企業所無法承擔的。

        中檢所這次對于新引入的培養基對應對照培養基是相當重視的,現在還在進行對照培養基的篩選工作,如果大家實時跟進中檢所的官網的話,可以發現TSA這個培養基的對照培養基已進行更換,其原來的克數是12g/300ml,現在是11.1g/300ml,當然要進行培養基的適用性審計,我們還是需要某些培養基的對照培養基的,所以實驗室必須盡早做出審計計劃購買對照培養基,一般是通過省所去中檢所進行購買,我們一起希望在2015版生效之前,對照培養基能夠齊全吧!

        6、 培養基的管理趨勢

        借鑒著名外企微生物實驗室的管理模式,微限、無菌、環境檢測的培養基均商購,然后進廠檢驗放行后使用,在產品檢驗完成后,再次進行結束檢驗,確認在使用過程中,該批培養基均符合使用要求。

        現在實驗室的培養基管理已經慢慢傾向于系統化的管理,很多外企使用商品化的培養基、商品化的定量菌株等,這樣將人員的專注力集中于實驗本身,其實這也是種風險共擔的管理模式,讓專業的人去做他專業的事情,在前端對商購的培養基進行嚴格的供應商審計,這樣也省卻了實驗室若出現OOS結果對自配培養基從配制到滅菌到貯存等在實驗室發生的一系列的調查,商購培養基可能只需對貯存、使用等進行調查即可。

         

        從成本上考慮,我相信國內的成品培養基生產企業也會跟上腳步,這樣對于國內藥企來說,實驗室自配和商購成品培養基的成本其實相差并不大,企業自身的人員管理壓力和成本壓力也會相應減小。


        所以回到之前的話題,培養基的篩選和供應商審計就顯得格外重要,我們要把困難的事情往前做,這樣我們就會有更多的精力去解決我們更重要的技術問題。培養基的管理是不斷進步的過程,我們實驗室碰了不少壁,但是收獲更多,相信大家肯定會有更多更好的建議,也期待大家的交流和意見!

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